RAS癌基因突变是人类癌症中最常见的激活突变，发生在30%的人类肿瘤中。尽管是最早发现的癌基因之一，但三十年的努力一直未能识别出临床上可行的KRAS蛋白抑制剂，主要有两个原因：(1)KRAS以皮摩尔亲和力与GDP和GTP结合，严重阻碍了开发核苷酸竞争抑制剂的努力；(2)KRAS蛋白缺乏其它深表面疏水口袋，阻碍了寻找高亲和力变构抑制剂的努力[1][2][3]。
事情在2013年出现了重大突破，Shokat等[4]报告了一种旨在克服这些挑战的新策略，该策略使用共价抑制剂来靶向KRASG12C的活性半胱氨酸。[5]。结晶学研究表明，在效应因子结合的Switch-II区域的下面形成了一个新的口袋，值得注意的是，突变体cys12位于与效应因子相互作用有关的核苷酸口袋和切换区附近，基于二硫化物的片段筛选法在GDP结合状态下利用完整蛋白质质谱法对有480个系链化合物的文库进行了筛选，得到了片段6H05和2E07，且两个片段化合物未检测到与含有3个天然半胱氨酸残基的野生型K-RAS的反应。
选取最优片段6H05进行构效关系研究，得到了最高活性化学物(6)，化合物6不结合在核苷酸口袋中，而是从Cys12延伸到主要由Switch-II组成的相邻口袋中。这种完全形成的口袋在RAS的其他已发表的结构中并不明显，尽管在某些情况下可以看到凹槽，以前的研究表明这个区域存在变构位点。将复合结合区称为Switch-II口袋(S-IIP) [4]。
S-IIP位于RAS的中心β-折叠与α2-(Switch-II)和α3-螺旋之间，明确的电子密度显示了化合物6在S-IIP内部的位置，并证实了6与Cys12之间的二硫键。6的疏水二氯苯基形成几个疏水接触。Glu99和Gly60形成直接氢键至6。而Switch-II对形成S-IIP有明显的重排作用，Switch-I的构象没有从GDP结合状态改变[4]。
Shokat等没有继续使用基于二硫化物的化合物，而是转向了碳基亲电剂、丙烯酰胺和乙烯基磺酰胺，得到了高效的丙烯酰胺类化合物，其中化合物12活性很好。同时又证明了化合物12不和野生型KRAS的半胱氨酸反应。覆盖多个共晶结构表明，化合物通过口袋遵循类似的轨迹，并将官能团投射到(o-)和(p-)子口袋中。尽管末端苯环上有相当大的差异，但这些化合物满足相似的疏水相互作用，支持S-IIP的这一区域的关键作用 [4]。
EDTA对核苷酸交换的催化作用表明，虽然化合物可能会微妙地影响金属结合，导致核苷酸亲和力的变化，但即使在S-IIP被占据的情况下，Mg2+也不能被排除。结构分析还预测，交换因子SOS的功能可能会受到与S-IIP结合的影响。用化合物8或12阻断SOS催化的核苷酸交换处理K-RAS(G12C)，如上所述，这些化合物不会损害EDTA催化的GDP交换[4]。
接着用免疫共沉淀法发现了化合物12将破坏RAS的GTP状态的构象，并损害与效应因子(如Raf)的相互作用。在一小部分基因表型的肺癌细胞系中研究了化合物12的作用。如预期的那样，与没有G12C突变的组(H1437、H1299和A549)相比，含有G12C突变的细胞系(H1792、H358、H23和CALU-1)在处理后显示出存活率降低和凋亡增加。高敏感的H1792细胞显示低水平的K-RASGTP，与抑制剂与K-RAS GDP的优先结合一致。它们是高度依赖K-RAS的。值得注意的是，缺乏G12C的K-RAS依赖性(A549)和非依赖性(H1299)细胞株对化合物12不敏感。化合物12在H1792细胞中的半数有效浓度(EC50)为0.32±0.01 μM[4]。
总体而言，细胞数据为S-IIP结合复合物在K-RASG12C驱动的癌症中的基因型特异性使用提供了概念验证。
Matthew P. Patricelli等[6]在化合物12的基础上继续探索，发现化合物12在含有KRASG12C突变的NCI-H358(H358)细胞中没有表现出实质性的KRASG12C共结合，即使在100 μmol/L化合物处理6小时后也没有表现出明显的KRAS 共结合。为了解决化合物12缺乏细胞活性的可能原因，需要更有效的Switch II口袋抑制剂，进行了基于迭代结构的共价KRASG12C靶向试剂的设计，并测试了它们对纯化的重组KRASG12C的活性以及它们在细胞中结合KRAS G12C的能力。ARS-853，给出了很大的希望。
在生化测定中，ARS-853与KRASG12C的结合速率常数为76M-1s-1，比化合物12提高了600多倍，细胞结合IC50在6小时为1.6 μmol/L。在GDP存在下，配体结合的KRASG12C的高分辨晶体结构将ARS-853的结合位点确定为前面描述的开关II口袋。在该结构中，ARS853共价连接到C12上，并延伸到位于KRAS的中心β-折叠与α2和α3螺旋之间的Switch II口袋区域。相对于其他已发表的开关II结合化合物的结构，ARS853诱导α2螺旋的旋转，伴随着M72的位移，以适应不同疏水口袋中的配体。这个疏水口袋被ARS-853的芳环占据，氯和甲基环丙基取代基提供了紧密的范德华接触，而酚羟基与D69形成了氢键。ARS-853丙烯酰胺的羰基与保守的K16和一个与通常的镁离子配位的水分子形成氢键，同时占据与KRAS的GTP结合形式的末端磷酸相似的位置。总体而言，该结构的多个特征表明，ARS-853结合的KRASG12C代表KRAS的非活性状态。[6]。
Matthew R. Janes等[6]进一步通过实验说明了ARS-853抑制KRASG12C癌蛋白在细胞内的功能，ARS-853细胞参与需要KRAS G12C癌蛋白上的核苷酸快速循环，KRAS G12C GTP水平受上游信号因子调控。
尽管获得了以上的突破，揭示以前未知的RAS结合口袋，研究者们也开展了大量的筛选试验，但它们只导致了有限的证明，同时都严重缺乏对靶向作用机制的令人信服的体内反应的证明[7][8]。Matthew R. Janes等[9]基于结构的药物设计，继续提高突变导向和KRAS特异性抑制剂的效力和类药物特性。研究发现ARS-853系列化合物的主要缺点是血浆代谢稳定性短(t1/2<20min)和小鼠口服生物利用度差(F<2%)，使其不能用于进一步的体内研究。有限的结构活性关系也限制了ARS-853系列的进一步效力改进。将重点转移到设计结构上不同的支架上，这些支架适当地定位丙烯酰胺的构象和轨迹，并允许最佳的疏水结合部分在S-IIP中的适当放置。我们假设ARS-853系列的柔性2-氨基-1-(π-哌嗪-1-基)乙烷-1-酮连接子可以缩短并被更刚性的双环支架取代，并适合由之前报道的ARS-853共晶结构重新封装的S-II和A3螺旋之间的空闲区域[6]。经过广泛的支架优化，我们确定喹唑啉核心是一种多功能支架，可以克服ARS-853的SAR限制，并具有更好的类药物特性。
这一进展导致了基于喹唑啉的系列，并在对支架周围的取代基进行系统优化之后，导致具有良好ADME/PK以及KRAS共价结合活性的显著改善[9]。
继续合成了几个喹唑啉系列活性较高的化合物，最引人关注的是化合物ARS-1620，它含有一个氟苯酚疏水结合部分，具有轴向手性，表现了S-阿托品对KRAS-12半胱氨酸的异构体反应性 [9]。
ARS-1620与KRASG12C结合的共晶结构显示了从最初的S-IIP KRASG12C抑制剂到Cys-12的独特结合模式和结合轨迹，并揭示了与His-95额外的关键相互作用的获得，从而获得了比ARS-853系列化合物更刚性、更有利的共价反应构象 [9]。
在生化实验中，ARS-1620共价修饰KRASG12C的观察速率比ARS-853提高了10倍，证明了ARS-1620对KRAS的修饰效力比以前的化合物有了明显的提高。ARS-1620优先与KRASG12C的GDP结合状态作用，缺乏对野生型(WT)-KRAS蛋白的任何残基的可检测到的反应性。此外，与ARS-1620共价结合的KRAS G12C缺乏SOS和EDTA介导的核苷酸交换能力。同时在细胞层面证实了ARS-1620的抑制活性，Pan-RAS中对KRASG12C的选择性[9]。
共价抑制剂的一个主要风险是可能与非靶蛋白发生非特异性反应。ATP口袋附近有200个带有反应性半胱氨酸的激酶[10]，同样地延伸到含有反应性半胱氨酸的非激酶蛋白[11]，如果被靶向，可能会产生不必要的特异性毒性。为了更好地定义ARS-1620可能的脱靶易感性和特异性，使用无偏见的化学蛋白质组筛选来评估细胞内的共价反应活性，分辨率覆盖3012个注释蛋白质的8501个半胱氨酸残基，最终证实了ARS-1620 靶点专一性[9]。
ARS-1620在小鼠体内表现出极好的口服生物利用度和足够的血液稳定性，使得可以定量测量体内G12C靶点占有率。目前仍不清楚ARS-1620是否能够满足足够的共价动力学和药代动力学特性，以使S-IIP G12C靶向方法在体内成功。为了说明ARS-1620是否具有体内靶点占有率的能力，在已建立的携带KRAS p.G12C的异种皮下移植模型中口服了ARS-1620。在单次口服剂量或连续5次每日剂量后，ARS-1620产生的平均肿瘤峰值浓度分别为1.5 μM (50 mg/kg)和6.5 μM(200 mg/kg)，这使得KRAS G12C靶点占据显著(≥70% G12C-TE在200 mg/kg)超过24小时。在这些暴露下，ARS-1620提供了显著的G12C目标占有率(75%至90%G12C-TE)以及RAS-GTP和下游信号抑制[9]。
接下来，通过动物模型试验证明了目标占有率能转化为体内的抗肿瘤活性。[9]。
对KRAS依赖性的系统评估揭示了体外和体内肿瘤模型对KRAS抑制的不同敏感性，也体现了3D-椭球体系统能很好的预测体内抗肿瘤反应活性。[9]。
最后在在PDX肿瘤模型中证明了ARS-1620有效和选择性的抗肿瘤活性。值得注意的是PDX1868含有EGFR T790M、L858R驱动突变，PDX0170在PMS2，MSH2，MSH6和APC中存在Lynch综合征突变。在所有采用的肿瘤模型中，ARS-1620在整个3周的治疗期间耐受性良好。此外，在CD-1小鼠身上没有观察到ARS-1620的临床症状或毒性，即使在7天内每天口服剂量高达1000毫克/公斤。在400 mg/kg以上，ARS-1620抑制了PK饱和度，因此在细胞系和PDX来源的模型中没有进一步增强抗肿瘤效果[9]。
总体而言，ARS-1620作为单一药物在NSCLC模型中广泛有效的体内证据提供了概念证明，即相当大一部分p.G12C KRAS突变的患者可能受益于KRAS G12C导向的治疗。Matthew R. Janes等对于ARS-1620研究提供了第一个体内证据，证明S-IIP靶向治疗方法可能是治疗KRAS p.G12C突变癌症患者的一种有前途的治疗策略。
参考文献：
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3. Cox, A.D.; Fesik, S. W.; Kimmelman, A. C.; Luo, J.; Der, C. J. Drugging the Undruggable RAS: Mission Possible? Nat. Rev. Drug Discov. 2014, 13, 828–851.
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11. Bioinformatics26, 966–968
