亮氨酸对粉雾剂分散性与空气动力学性质的改良

       粉雾剂处方开发的难点在于微粉化的活性药物成分(API)的流动性和雾化性能较差。通常将API与载体混合来解决这一问题。吸入制剂的辅料对安全性有严格的要求。目前可用于肺部吸入的辅料有乳糖、甘露醇和葡萄糖。氨基酸作为内源性物质而被重点研究。其中L-亮氨酸最为常见，它能够改善粉体的分散性，并使粉体隔离水分。此外，L-亮氨酸的对映体D-亮氨酸在粉雾剂中也有相关应用。本文从处方制备方法出发，对比共喷雾干燥法与物理混合法制备干粉的优劣。再通过粉体性质与物理化学性质的研究，说明亮氨酸的作用机理和应用特点。最后对亮氨酸在吸入制剂中应用的机遇与挑战进行总结。

       一、制备方法

       含亮氨酸干粉处方的制备方法有以下两种：

       (1) 亮氨酸与API共喷雾干燥。

       (2) 喷雾干燥 对亮氨酸进行改性后，再与API混合得到最终混粉。

       共喷雾干燥工艺将API与亮氨酸共同溶解于溶剂中，在一定条件下喷雾干燥直接获得无乳糖载体的干粉。另一种制备方法是通过喷雾干燥法获得目标粒径和一定晶体形貌的亮氨酸。随后采用高剪切或低剪切混合法对API与亮氨酸进行混粉。

       共喷雾干燥法通过调控喷雾工艺参数、溶液浓度与溶剂种类等因素对粉体的粒度、形态和堆密度等重要性质进行控制。可以直接制备混粉，操作步骤少。但是喷雾干燥过程的能耗高且昂贵。此外，多数化合物在喷雾干燥后会面临API的无定形含量增加的问题。相比较而言，低剪切与高剪切混合更为简单经济，并且应用广泛。采用这种物理混合方法制备干粉处方，可在一定程度上减少对API与辅料的破坏。但应通过调控混合时间与强混合强度等参数，保证混粉的含量均匀度。

       2、处方优势

       2.1. L-亮氨酸

       许多研究采用共同喷雾干燥法制备含有L-亮氨酸的干粉制剂处方。研究发现该处方存在以下特点：

       (1) 喷雾干燥干粉收率与亮氨酸加入量有关。重酒石酸卡巴拉丁(RHT)、菊糖(Inu)与L-亮氨酸(Leu)的1%乙醇水溶液喷雾干燥处方收率随L-亮氨酸含量的增加而增加，如图1所示 [1] 。

图1  RHT-Inu-Leu喷雾干燥收率与Leu添加量的关系 [1]

       (2) 由亮氨酸组成的微粒形态取决于制剂中L-亮氨酸的比例，一般为表面塌陷的褶皱球形颗粒。L-亮氨酸具有相对疏水性和表面活性剂的特性。这与亮氨酸分子中存在较强疏水性烷基侧链有关。亮氨酸分子在水溶液中显示出表面活性，并且容易在空气-溶剂界面处聚集。此外，亮氨酸的低溶解度使其在开始喷雾干燥时迅速达到过饱和，从而在干燥液滴表面成核形成疏水性外壳。干燥过程中，随着溶剂的蒸发，液滴表面上的L-亮氨酸不能迅速收缩，从而造成表层塌陷形成褶皱的外表面。RHT-Inu-Leu通过共喷雾干燥制备的干粉SEM如图2所示。可见不含L-亮氨酸的处方为光滑的球形颗粒。含有亮氨酸干粉的晶习为褶皱状或类似于葡萄干状，并且粗糙度随亮氨酸加入量的增加而变高。

图2  7.5%w/w RHT和(A) 0%，(B) 5%，(C) 10%，(D) 15%与(E) 20%Leu处方SEM [1]

       (3) 堆密度与振实密度随亮氨酸含量的增加而变大。堆密度与振实密度受颗粒形状、粒度与颗粒间接触行为的影响。包含亮氨酸的处方粒径明显较小，一定体积下可以堆积更多粉末。此外加入亮氨酸后，干粉的颗粒形状与接触行为的改变导致粒子的堆积方式发生变化，即较小的粒子趋于更紧密的堆积，粒子间隙变小。并且褶皱形状的晶习比球形更紧密的堆积，从而导致颗粒机械互锁而减少间隙。 RHT-Inu-Leu 共喷雾干粉处方中L-亮氨酸含量与干粉堆密度和振实密度的关系如图3所示。

图3  RHT-Inu-Leu共喷雾干粉处方中亮氨酸含量与干粉堆密度和振实密度的关系 [1]

       (4) L-亮氨酸喷雾干燥后具有一定的结晶度，而不是完全的无定型。Sou等 [2] 在研究中提出L-亮氨酸经过喷雾干燥后表现出部分有序的分子排列。通过干燥L-亮氨酸在API表面结晶成膜，分子具有较强的二维有序性，但并未完全建立三维有序性。Alice等 [1] 在研究中发现随亮氨酸含量的增加，喷雾干燥后干粉在2-Theta=6.1°与19.1°处衍射峰(L-亮氨酸特征峰)强度逐渐变大。说明L-亮氨酸为结晶态。

       (5) 由于L-亮氨酸的强疏水性，在90%RH条件下几乎不吸湿。将L-亮氨酸包裹在吸湿性强的活性药物表面可以起到隔绝水分的作用。

       (6) 添加L-亮氨酸的喷雾干燥处方可以明显改善空气动力学性质。该处方在低截止粒径(<3μm)沉积量高，并且MMAD较低，说明颗粒可以轻松达到肺泡囊而起效。这与加入L-亮氨酸后对粒度分布和晶体形貌的改善有关。

       2.2. D-亮氨酸

       D-亮氨酸在干粉制剂中的应用不像L-亮氨酸那样普遍。但有报道[3]指出D-亮氨酸作为一种新型辅料可以改进微粉化布地奈德的空气动力学性质。下面将该篇论文的研究要点总结如下：

       (1) D-亮氨酸进行喷雾干燥后，与微粉化布地奈德混合制备干粉。该方法区别于L-亮氨酸处方常用的共喷雾干燥法。运用喷雾干燥法制备D-亮氨酸的优势在于可以通过调控溶液组成、浓度、干燥气体、干燥温度、相对湿度和液滴尺寸等因素对亮氨酸的形态、密度、流动性与分散性等进行改性。

       (2) 喷雾干燥溶液的D-亮氨酸浓度与溶剂类型影响颗粒粒度、形态和收率。首先试验数据表明疏水性溶剂比亲水性溶剂收率高。并且收率随D-亮氨酸起始浓度的增加而提高。研究中用湿法测定喷雾干燥后D-亮氨酸的粒度。测试结果比预期大，并且粒度分布宽。经SEM对比后确定以上结果是颗粒团聚所致。如图4所示，D-亮氨酸为扁平状晶体，而微粉化布地奈德为不规则的小颗粒。D-亮氨酸喷雾干燥后，颗粒表面出现褶皱并且内部孔隙增多，其粒度主要受到溶剂和亮氨酸浓度的影响。这种晶体形貌与D-亮氨酸的疏水特性和表面活性剂特性相关。D-亮氨酸在干燥过程中集中在溶剂-空气界面(与L-亮氨酸相同)，从而限制了溶剂的蒸发。因此液滴尺寸增加，并且在完全蒸发后，亮氨酸表层塌陷得到低密度颗粒。

图4  SEM：D-亮氨酸、微粉化布地奈德，不同溶液和亮氨酸浓度下喷雾干燥获得的D-亮氨酸颗粒 [4]

       (3) 通过喷雾干燥改性获得的D-亮氨酸与API混合后得到的混粉均匀性好。布地奈德和D-亮氨酸的混粉中，布地奈德粘附在亮氨酸表面(见图5)。布地奈德与喷雾干燥D-亮氨酸A的混粉中，布地奈德为不规则的小颗粒，D-亮氨酸A为不均匀的空心大颗粒，通过晶体形貌可以很容易区分。在图5中可以看出布地奈德与D-亮氨酸B的混合物更加均匀，并且亮氨酸粒度更小，很难与布地奈德粒子区分。经SEM-EDX表征，D亮氨酸A或B与布地奈德的混合均匀性均较高。

       图5. SEM布地奈德:D-亮氨酸(1:1)，布地奈德:D-亮氨酸A(10:1)(0.25%w/w水溶液喷雾干燥获得亮氨酸A)，布地奈德:亮氨酸B(10:1)(0.25%w/w乙醇水溶液喷雾干燥获得亮氨酸B) [4]

       (4) D-亮氨酸与L-亮氨酸的晶胞参数与红外图谱基本一致，表明二者具有一定的相似性。这也说明了D-亮氨酸与L-亮氨酸在处方中互换的可能性。

       (5) 喷雾干燥后的D-亮氨酸提高布地奈德干粉制剂的微细粒子剂量(FPF)。亮氨酸粒度越小，FPF提高越显著。需要指出布地奈德和亮氨酸的投料比例影响空气动力学性质。布地奈德和亮氨酸的投料比减小，即亮氨酸的含量增加，越能突出亮氨酸在干粉中的优势，从而表现为粉体的FPF增加。

       3、机遇与挑战

       CDE辅料数据库[5]中指出亮氨酸在药剂中作药物载体使用，以增强药物的溶解性或增强药物的作用，并减少副作用。亮氨酸是人体必须氨基酸，是营养成分，无毒，一般认为是安全的。FDA IIG辅料数据库[6]亮氨酸静脉输液的单剂量最大用量为526 mg，口服单剂量最大用量为4.5 mg，但未发现吸入制剂安全用量有关数据。

       亮氨酸对于干粉制剂粉体性质与空气动力学性质的改善有着突出表现。为干粉制剂的制备提供了一个绝佳的方案。尽管亮氨酸为机体必须的小分子代谢物，但研究者仍然面临着吸入用亮氨酸安全用量的问题。因此如何或怎样将亮氨酸用于吸入制剂，并探索其安全用量同样是一项艰巨的挑战。

       参考文献

       [1] Alice, S., Maria, I.A., Lucio, M.C., Anne. M.H.,Valeria, P.S., 2016. Development of a novel dry powder inhalation formulation for the delivery of rivastigmine hydrogen tartrate. International Journal of Pharmaceutics. 501, 124-138.

       [2] Sou, T., Kaminskas, L.M., Nguyen, T., Cariberg, R., Mclntosh, M.P., Morton, D.A.V., 2013. The effect of amino acid excipients on morphology and solid-state properties ofmulti-component spray-dried formulation for pulmonary delivery of biomacromolecules. Eur. J. Pharm. Biopharm. 83, 234-243.

       [3] Hoe, S., Matinkhoo,S., Boraey, M., Ivey, J., Shamsaddini-Shahrbabak, A., Finlay, W., Vehring, R.,2013. Substitution of L-leucine with D-leucine in spray-dried respirablepowders for control of Psedomonas aeruginosa infection. In: Presented at theInternational Society for Aerosols in Medicine, Chapel Hill.

       [4] Aurelie S.,Riccardo V., Marco P., Diego R.P., Antimo G., Antonio M., Maurizio R.,D-leucine microparticles as an excipient to improve the aerosolizationperformances of dry powders for inhalation. European Journal of PharmaceuticalSciences. 130 (2019) 54-64.

       [5] CDE常用辅料数据库. www.cde.org.cn/drugInfo.do?method=fuliaoView&flId=96

       [6] FDA. InactiveIngredient Search for Approved Deug Products.

       www.accessdata.fda.gov/scripts/cder/iig/index.cfm?event=BasicSearch.page