口服生物可利用的、可逆的FXIa抑制剂作为新型抗凝血药物，具有较高的安全性和效果，特别适合慢性血栓性疾病的治疗。拜耳公司公开了开发口服FXIa抑制剂Asundexian的优化过程。该化合物首先通过基于结构的设计获得初始Hit化合物3经过替代高能量水分子、优化亲和力、预组织构象、填充额外亲脂口袋、减少代谢软点、掩盖极性氢等方式调整亲和力和每日一次口服给药所需的DMPK，最终获得临床候选化合物Asundexian。Asundexian目前已进入多个III期临床试验，用以治疗房颤和缺血性卒中，展现出广阔的应用前景。本文梳理了Asundexian的设计策略与优化路线，可为类似项目结构优化提供宝贵经验。
心脑血管疾病的发病率不断上升，临床上对药物的需求也日益增长。相较于现有药物，FXIa抑制剂能够通过靶向作用体内的凝血途径，从而避免对止血功能产生影响，可是更为安全有效的抗凝血剂。
根据中国药物临床试验登记与信息公示平台官网公示，拜耳（Bayer）已登记两项关于口服FXIa抑制剂Asundexian（BAY2433334）的国际多中心（含中国）III期临床研究，针对的适应症分别为预防房颤患者卒中或体循环栓塞，以及预防患有急性非心源性栓塞型缺血性脑卒中或高风险短暂性脑缺血发作患者的缺血性脑卒中。
近日JMC报道了有关Asundexian发现工作。研究人员通过基于蛋白质结构的从头设计确定了微摩尔级别的Hit。继续优化平衡效价和吸收，改善代谢稳定性、细胞色素P450相互作用谱和临床DMPK，验证了其药理学功能。整体设计方案贯穿了化合物构象行为和官能团行为的设计思想，保证官能团与目标蛋白的强相互作用，刚化FXIa预组织构象保持重要氢键作用，优化合适的低极性表面，实现效价和吸收的平衡。
设计和优化过程总结如下
part .01
Hit发现
研究人员最初对Bayer AG内部包含430万种化合物的数据库进行高通量筛选未得到有效Hit，转而采用SBDD方法进行从头设计可逆，靶向活性位点的化合物。
受BMS2007年发表的四氮唑化合物启发，定义口服FXIa抑制剂重要相互作用：
（1）亲脂性芳香基团（最好是氯芳基取代基）占据S1口袋；
（2）羰基占据氧阴离子孔（OAH），并可与Lys192和Gly193的主链NH基团形成一个或两个强氢键；
（3）强氢键受体作用于S1口袋边缘Gly216的主链NH；
（4）强氢键供体（如NH基团）作用于捕获水分子（位于Leu39和Ser195之间）；
（5）linker携带中性或酸性官能团，能够接受两个氢键（来自Tyr143和另一捕获水分子）
（6）由于这个设计概念涉及相对较多的极性官能团，期望使用亲脂性linker连接。
以杂芳香核为中心进行枚举，经过对接、能量评价，获得化合物3，具有微摩尔效价，对其他丝氨酸蛋白酶（如凝血酶、FXa、胰蛋白酶）具有良好的选择性（所有IC50均大于50μM）。
part .02
Lead寻找
使用表征配体结合口袋内容纳估计结构和能量的分子动力学方法watermap，计算底物结合口袋中的水分子的作用能和熵变，寻找能量贡献位点（S1>S2>S1`>S1边缘>EBP）。
为了提高化合物3的效力，邻位取代P1氯芳基额外填充EBP和S1`。并通过预组织吡啶酮和氯芳基环之间的二面角来进一步提高药效。研究人员提出，这个由FXIa共晶的3的这个二面角理想角度为-66°。目标设定为探索由一个或两个非氢原子组成的相对较小的，极性不太强的取代基占据EBP，经枚举对接排序，结果表明o-CN为局部最优。
S1`口袋的能量不利的水分子，以亲脂性基团取代，化合物效力增加了10倍以上。
探索C5取代基，旨在与主链Gly216形成相互作用，枚举各种取代基与EBP组合，计算排序。Cl取代物通过构象限制效价提高6倍。通过引入OCH3提供与Gly216主链形成氢键，效价提高29倍。化合物24，FXIa效价IC50为2nM，clogD7.5为1.6，性质良好，接下来优化人血浆抗凝活性。
进一步探索P1`基团，引入甲氧乙基取代基，醚氧与Ser195捕获水分子的额外氢键作用，抗凝血活性有所增加，整合入环醚，提高了溶解度。在这个过程中化合物34被认为是综合性质最 好的化合物，被用于首次人体研究评估，然而，化合物34口服暴露量和人类半衰期的不达预期。推测需要修改其羧酸部分。
part .03
P2`的调整
由于中心酰胺键NH与Leu39通过水介导形成的相互作用必不可少，必须保持此苯胺结构；为了避免潜在毒 性，需使用Ames阴性苯胺；并保证同时与His38、Arg37D和Tyr143形成氢键。枚举一系列非酸性P2`基团。用FEP+计算结合自由能，化合物43二氢吲唑啉酮满足条件，但tPSA高，Caco-2实验中几乎没有渗透性，并且显示高外排。
将二氢吲唑啉酮改成氨基甲酰基（其中NH2一个氢参与分子内氢键，掩盖极性）或其他非酸性P2`衍生物提高了渗透性，但大鼠体内清除率较高，需要改善。
part .04
再次调整P1`调节代谢稳定性
研究分子在大鼠和人肝细胞中的代谢发现，P1`是代谢软点，采用保持P1`小，减少代谢位点的策略优化得到乙基取代。
part .05
再次调整EBP提升效力
根据体内药理学对单一立体异构体的效价目标为个位数纳摩尔级别，aPTT实验中延长血浆凝固时间，实验体积下，EC50<50μM。调节理化性质放弃了P2`羧酸，P1`烷基醚的扩展，再次调整效力的空间只剩EBP。
选取五元杂芳基进行探索，希望通过调整C5，N4调整提高效力维持渗透。枚举组合，计算FEP+排序。测试后分析SAR，得出五元杂环以卤素原子取代后，卤素与Gly218主链NH形成氢键；杂芳环上邻三唑提升氢键强度。EBP最 好的片段为1，2，3-三氮唑-1-基。
part.06
P2`再评价和candidate选择
确定氯、三氟甲基或二氟甲基取代基的三唑为EBP首选，甲基或乙基小烷基是P1`的有利选项之后，再次优化P2`。尝试了不同取代考量CYP3A4抑制、Ames测试、外排、代谢稳定性等原因确定F取代的氨基甲酰基为最优片段。
最后的修饰周期设计了3*3矩阵：CHF2、CF3、Cl；Me、Et、n-Pr；确定80（Asundexian）为候选化合物。
临床候选物Asundexian的结合特征
P1氯芳基与Tyr228形成π-阳离子相互作用，取代能量不利的水分子；
中心酰胺NH形成水介导的氢键；
末端P2酰胺一个氢与Tyr143的酚羟基之间形成氢键；酰胺羰基与Arg37D形成一个氢键，与His414形成水介导的氢键；
取代三氮唑的一个氟与Gly218形成氢键；
乙基指向S1 口袋形成亲脂作用；
甲氧基氧和Gly216之间形成氢键；
吡啶酮羰基与OAH中Gly193, Ser195形成氢键。
对Asundexian的深入评价显示，在缓冲液中测试IC50=1.0 nM和在人血浆中接触激活后测试IC50=0.14 μM，对FXIa具有有效的可逆抑制作用。
Asundexian抑制FXIa最接近的同源物人血浆钾激肽，缓冲液中的IC50值为6.7 nM，人血浆中的IC50值为1.23 μM。
Asundexian对与止血系统相关的丝氨酸蛋白酶，包括FVIIa、FIXa、FXa、FXIIa、凝血酶、尿激酶、组织纤溶酶原激活剂、活化蛋白C或纤溶蛋白，以及其他与口服给药途径相关的潜在重要蛋白酶，如胰蛋白酶、凝乳胰蛋白酶和钙脱蛋白（凝乳胰蛋白酶C），显示出超过1000倍的良好选择性。
在人血浆中加入Asundexian后，aPTT实验的凝血时间延长，EC150为0.20 μM（以最终检测体积150 μL计算），以血浆浓度（50 μL）计算EC150为0.61 μM。家兔、犬、小型猪和豚鼠血浆样品的aPTT均有延长，EC150值分别为4.5、4.8、1.5和6.4 μM，而小鼠和大鼠血浆样品（EC150>30 μM）的凝血时间未见延长。
在体内，通过多种血栓形成模型测定了Asundexian的抗血栓作用。在FeCl2诱导的兔颈动脉损伤模型中，与对照动物相比，剂量依赖性地减少血栓重量，在最高剂量下以预防方式静脉注射，几乎完全减少了血栓重量，ED50为380 mg/L。而在同时进行的耳出血时间测量中，未观察到影响。当Asundexian与抗血小板药物(阿司匹林和替格 瑞洛)联用时，这种不增加出血时间的强抗血栓疗效得到了证实，并得到了静脉血管（FeCl2诱导的家兔颈静脉损伤）和动静脉分流模型研究的支持。当以PEG/乙醇/水溶液的10和30 mg/kg剂量家兔口服给药时，分别使血栓重量减少30%和91%。
对于早期化合物，可逆的和时间依赖性的CYP抑制是一个至关重要的参数。Asundexian对CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C19、CYP2E1、CYP2J2和CYP3A4活性的影响不超过最高测试浓度（IC50>41 μM）。对CYP2C8（IC50=3.6 μM）、CYP2C9（IC50=17 μM）、CYP1A1（IC50=13 μM）和CYP2D6（IC50=19 μM）有较弱抑制。
此外，Asundexian与NADPH补充的人肝微粒体预孵育（30 min）后，仅对CYP3A4的抑制效力略有增加（IC50=17 μM）。在人肝细胞中进一步研究，未观察到对CYP3A4抑制剂量依赖性。
在Caco-2细胞肠吸收模型中，Asundexian表现出高通透性[Papp(A?B)=143 nm/s]和中等流出比7。使用平衡透析法3H标记原药测定血浆中游离Asundexian，在大鼠（2.4%）、猴（6.2%）和人（6.4%）血浆中游离中等，犬（10%）和家兔（14%）血浆中游离率较高。
雄性Wistar大鼠和雌性beagle犬经静脉（0.3 mg/kg）和口服（1.0 mg/kg）给药后，Asundexian显示低清除率（大鼠0.46 L/h/kg，犬0.19 L/h/kg），高分布体积（大鼠0.76 L/kg，犬1.80 L/kg），中高生物利用度（大鼠60%，犬97%）。
part
临床I期实验结果
Asundexian显示出一致的PK/PD关系，药效学参数(如抗凝血活性（aPTT）和FXIa抑制活性呈剂量依赖性变化，而出血时间在所有剂量组中一致，与安慰剂相似。没有观察到临床相关的出血事件或对出血时间的影响。
在单剂量和多剂量人体药代动力学研究中，Asundexian暴露量呈剂量依赖性，口服生物利用度高，经速释片给药后，几何平均消除半衰期约为14 - 17小时。因此，Asundexian是一种有潜力日给药一次的临床候选化合物，在房颤患者PACIFICAF18（NCT04218266）、非心源性卒中患者PACIFIC-STROKE19（NCT04304508）和急性心肌梗死患者PACIFIC-AMI 20（NCT04304534）三个II期剂量研究中研究了其有效性和安全性。
目前，正在进行房颤患者以及非心源性缺血性卒中或高风险瞬时缺血性发作患者中预防卒两项OCEANIC III期研究，涉及多达30,000例患者（OCEANIC-AF和OCEANIC-STROKE），以验证Asundexian的有效性和安全性。美国食品和药物管理局（FDA）已批准Asundexian作为非心脏栓塞性缺血性中风患者二级预防的潜在治疗药物的快速通道资格。
