细胞凋亡抑制蛋白（IAP，Inhibitor of Apoptosis）是功能上和结构上相关的蛋白质家族，其作为程序性细胞死亡（细胞凋亡）的内源性抑制剂。
IAP是细胞凋亡和促存活信号通路的重要调节因子，其失调通常与肿瘤发生和生长息息相关。
IAP抑制剂可分为Smac模拟物和非肽类小分子两类。目前，全球尚无IAP抑制剂获批上市，IAP不仅可以作为药物靶标，也可以作为E3连接酶设计特异性和非遗传IAP依赖性蛋白消除剂SNIPERs降解靶标蛋白，还可以连接其它E3连接酶配体合成异型双功能降解剂。
01
IAP结构与功能
细胞凋亡或程序性死亡是一种天然的细胞周期过程，旨在消除体内不需要或受损的细胞。在健康组织中，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白间存在良好的调节平衡，二者共同作用调控细胞凋亡。但是，癌细胞通过上调抗凋亡蛋白的表达，抑制细胞凋亡，最终导致肿瘤的生长、预后不良和耐药性等问题。
IAP通过多种机制，在调节细胞死亡过程中发挥关键作用。
哺乳动物IAP家族中有八个成员：细胞IAP1（c-IAP1）、X染色体连接IAP（XIAP）、细胞IAP2（c-IAP2）、神经元IAP（NAIP）、泛素结合BIR结构域酶（BRUCE）、存活蛋白、IAP样蛋白2（ILP2）和黑色素瘤IAP（ML-IAP）[1]。
IAP由三个BIR结构域（BIR1至BIR3）、一个泛素相关（UBA）结构域和一个C末端RING结构域组成。cIAP1/2还包含一个CARD域（图1）[2,3]。
图1. IAP蛋白的结构域组织
XIAP是唯一直接与半胱天冬酶3/7结合并抑制其活性的IAP（图2A）。Smac/Diablo和SM涉及不同细胞途径的靶向同源IAPs。半胱天冬酶/IAP直接结合第二线粒体衍生的半胱天冬酶激活剂（Smac/Diablo），激发了大量化合物的设计和合成，称为Smac模拟物（SMs）。
XIAP抑制剂（半胱天冬酶-9，绿色表面）和效应半胱天冬酶（半胱天冬酶-3和-7，洋红色表面），与 II 类BIR（分别为BIR3和BIR2）相互作用。
特别是，II型BIR显示为一个保守的IBM凹槽（蓝色缩放视图中的区域），其中包含在球体中报告的N端IAP结合基序（IBM）。Smac/Diablo在压力刺激下从线粒体释放，取代通过暴露N末端四肽Ala-Val-Pro-Ile（AVPI）（橙色球体）的半胱天冬酶，这是SM的设计基础。图2B显示cIAPs作为无活性单体存在于细胞质中[3]。
图2. Smac/Diablo和SM涉及不同细胞途径的靶向同源IAPs
治疗诱导cIAP1/2的二聚化和快速自泛素化，可以导致其降解。除了对半胱天冬酶的抑制作用外，IAPs还参与肿瘤坏死因子-α（TNFα）诱导的细胞死亡信号传导。
02
IAP拮抗剂
最初研究者开发了一种IAP拮抗剂，灵感来自于AVPI肽，称为第二线粒体衍生的半胱天冬酶激活剂（SMAC）的N末端序列。SMAC干扰XIAP与半胱天冬酶-9相互作用，抑制细胞凋亡。SMAC与cIAP1/2相互作用，并诱导构象变化，导致自我泛素化和自我分解。
这些结果表明，cIAP1/XIAP的双重拮抗剂可通过外源性和内源性途径，促进细胞凋亡。早期拟肽IAP拮抗剂已从单价形式演变为二价形式，以最大限度地提高其功效（图3）[4]。
近期，Astex Pharmaceuticals推出了第一个非肽型IAP拮抗剂，称为tolinapant，目前作为晚期实体瘤和淋巴瘤的靶标进行临床试验（图3，NCT02503423），加强了IAP作为抗癌治疗靶点的重要性[5]。
图3. 近期开发的第二种线粒体衍生的半胱天冬酶激活剂（SMAC）的凋亡蛋白（IAP）拮抗剂的模拟抑制剂
03
E3连接酶
E3连接酶可以分成RING、HECT、RBR等家族，每个家族下又有其他分型。目前已知的E3连接酶约有600多种，但在PROTAC中常用配体的相关E3连接酶只有 CRBN、VHL、IAP、MDM2等四种（图4），此外还有DCF15、RNF114、DCAF16、KEAP1、FEM1B等仅有少数配体报导的E3连接酶。
图4. 常见的E3连接酶配体
除此之外，也已开发出了很多新型结构E3连接酶配体，如图5所示新型CRBN配体[6]。
图5. 新型CRBN配体
近些年来，人们也在开发不同的E3连接酶用于PROTAC设计。如2021年，Ishida等人专注于发现用于PROTAC的新型E3泛素连接酶的新方法。这些方法包括分子建模方法，例如基于晶体学数据收集信息的SBDD和FBDD方法、基于活性的蛋白质分析（ABPP）筛查或表型筛查。通过这些方法，他们发现一些可以用于PROTACs设计的E3连接酶（图6）[6]。
图6. 尚未探索用于PROTAC应用的E3泛素连接酶列表
04
基于IAP设计的SNIPERs
基于IAP抑制剂可以设计SNIPERs，SNIPERs与PROTAC相似，可以招募E3连接酶来降解靶标蛋白，只是用的E3连接酶配体是IAP抑制剂。
乌苯美司（BS）及其衍生物，显示出与IAP的BIR3结构域的结合活性，因此诱导自我泛素化的蛋白酶体降解，或者使其它蛋白泛素化从而被降解。
由于IAP具有如此高的亲和力，人们可以基于BS结构衍生得到SNIPERs（如图7A所示）。Natio等人报道，甲基乌苯美司（MeBS）可以增强癌细胞对癌症药物诱导的细胞凋亡的化学敏感性，从而促进细胞凋亡[7]。
机理研究揭示，MeBS诱导RING依赖性自身泛素化和通过与cIAP1的第三个BIR域结合，诱导cIAP1蛋白酶体降解（如图7B所示）。SAR研究表明，即使用更庞大的基团取代羧酸甲酯，cIAP1水平仍能保持降低，表明MeBS的羧酸甲酯基团没有与cIAP1形成相互作用。这些结果促使Natio等人扩展分子框架以设计SNIPER，从甲基的位置连接接头，该接头进一步连接到对靶蛋白具有内在活性的分子上，如图7C所示。
图7.（A）乌苯美司及其衍生物的分子结构；（B）报道的cIAP降解机制；（C） SNIPERs作用机制
除了乌苯美司及其衍生物之外，化合物1（图3）也被选为开发降解剂的IAP抑制剂，因为它是现有二价IAP拮抗剂的一部分（图3），如化合物20通过泛素蛋白酶体系统（UPS）招募IAP来降解RIPK2（图8）[8]。
图8. 基于IAP设计的PIPK2的PROTAC
05
异型双功能泛IAP降解剂
E3连接酶不仅可以被用来设计PROTACs或SNIPERs，也可以作为靶标蛋白被降解，之前也已经有很多异型双功能降解剂被报道，如连接CRBN配体和VHL配体招募E3连接酶VHL，来降解CRBN蛋白的降解剂CRBN-6-5-5-VHL，或连接MDM2配体和CRBN配体招募E3连接酶CRBN，来降解MDM2蛋白的降解剂MD-224等（图9）[9]。
图9. 异型双功能E3连接酶降解剂
近期，Seulki等人在EJMC上报道了一类异型双功能泛IAP降解剂，他们合成了十几个化合物，并评估它们在MCF-7细胞中对cIAP1、cIAP2和XIAP的降解作用，最终发现化合物12（图10）在0.1 mM和1 mM浓度时，对cIAP1、cIAP2和XIAP都有超过95%的降解（除了在0.1 mM对cIAP1有87%的降解）[4]。
图10. 化合物12（TD-1092）的结构和降解活性
而且，Yuen在JMC也发表了连接IAP配体和VHL配体或者CRBN配体，来设计异型双功能泛IAP降解剂（图11）[9]。
图11. 异型双功能E3连接酶降解剂
他们设计了三种不同系列的异型双功能降解剂，其中两种与VHL配体不同位置连接而得，另一种与CRBN配体连接，从图12可以看出大部分化合物对三种IAP蛋白有很明显的降解功能。
图12. 三种不同类型的异型双功能降解剂
他们最终发现化合物9对三种IAP蛋白（cIAP1、cIAP2和XIAP）都有很明显的降解作用，而且它对多种细胞系有很明显的抑制生长作用（图13）。
图13. 化合物9的结构与活性
06
小结
细胞凋亡或程序性死亡是一种天然的细胞周期过程，旨在消除体内不需要或受损的细胞。在健康组织中，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白间存在良好的调节平衡，二者共同作用调控细胞凋亡。但是，癌细胞通过上调抗凋亡蛋白的表达，抑制细胞凋亡，最终导致肿瘤的生长、预后不良和耐药性等问题。
据预测到2030年，细胞凋亡市场规模有望达到36.3亿美元，2022-2030年复合增长率达31.7%。
细胞凋亡抑制蛋白是功能上和结构上相关的蛋白质家族，其作为程序性细胞死亡（细胞凋亡）的内源性抑制剂。IAP可直接结合含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase），抑制Caspase的活性，预防细胞凋亡。
IAP抑制剂可分为Smac模拟物和非肽类小分子两类，其中Smac模拟物可依据结合位点的数目分为单体和二聚体抑制剂，包括LCL161、AT-406等；二聚体抑制剂可激活Caspase-3/7/9的活性，达到促进细胞凋亡的目的，包括APG-1387等。
目前全球尚无IAP抑制剂获批上市，IAP不仅可以作为药物靶标，也可以作为E3连接酶设计SNIPERs降解靶标蛋白（化合物20通过UPS系统招募IAP来降解RIPK2），而且还可以连接其它E3连接酶配体合成异型双功能降解剂（如异型双功能泛IAP降解剂9和12）。
