细胞凋亡抑制蛋白（IAP，Inhibitor of Apoptosis）是功能上和结构上相关的蛋白质家族，其作为程序性细胞死亡（细胞凋亡）的内源性抑制剂。
IAP是细胞凋亡和促存活信号通路的重要调节因子，其失调通常与肿瘤发生和生长息息相关。
IAP抑制剂可分为Smac模拟物和非肽类小分子两类。目前，全球尚无IAP抑制剂获批上市，IAP不仅可以作为药物靶标，也可以作为E3连接酶设计特异性和非遗传IAP依赖性蛋白消除剂SNIPERs降解靶标蛋白，还可以连接其它E3连接酶配体合成异型双功能降解剂。
IAP结构与功能
细胞凋亡或程序性死亡是一种天然的细胞周期过程，旨在消除体内不需要或受损的细胞。在健康组织中，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白间存在良好的调节平衡，二者共同作用调控细胞凋亡。但是，癌细胞通过上调抗凋亡蛋白的表达，抑制细胞凋亡，最终导致肿瘤的生长、预后不良和耐药性等问题。
IAP通过多种机制，在调节细胞死亡过程中发挥关键作用。
哺乳动物IAP家族中有八个成员：细胞IAP1（c-IAP1）、X染色体连接IAP（XIAP）、细胞IAP2（c-IAP2）、神经元IAP（NAIP）、泛素结合BIR结构域酶（BRUCE）、存活蛋白、IAP样蛋白2（ILP2）和黑色素瘤IAP（ML-IAP）[1]。
IAP由三个BIR结构域（BIR1至BIR3）、一个泛素相关（UBA）结构域和一个C末端RING结构域组成。cIAP1/2还包含一个CARD域（图1）[2,3]。
图1. IAP蛋白的结构域组织
XIAP是唯一直接与半胱天冬酶3/7结合并抑制其活性的IAP（图2A）。Smac/Diablo和SM涉及不同细胞途径的靶向同源IAPs。半胱天冬酶/IAP直接结合第二线粒体衍生的半胱天冬酶激活剂（Smac/Diablo），激发了大量化合物的设计和合成，称为Smac模拟物（SMs）。
XIAP抑制剂（半胱天冬酶-9，绿色表面）和效应半胱天冬酶（半胱天冬酶-3和-7，洋红色表面），与 II 类BIR（分别为BIR3和BIR2）相互作用。
特别是，II型BIR显示为一个保守的IBM凹槽（蓝色缩放视图中的区域），其中包含在球体中报告的N端IAP结合基序（IBM）。Smac/Diablo在压力刺激下从线粒体释放，取代通过暴露N末端四肽Ala-Val-Pro-Ile（AVPI）（橙色球体）的半胱天冬酶，这是SM的设计基础。图2B显示cIAPs作为无活性单体存在于细胞质中[3]。
图2. Smac/Diablo和SM涉及不同细胞途径的靶向同源IAPs
治疗诱导cIAP1/2的二聚化和快速自泛素化，可以导致其降解。除了对半胱天冬酶的抑制作用外，IAPs还参与肿瘤坏死因子-α（TNFα）诱导的细胞死亡信号传导。
IAP拮抗剂
最初研究者开发了一种IAP拮抗剂，灵感来自于AVPI肽，称为第二线粒体衍生的半胱天冬酶激活剂（SMAC）的N末端序列。SMAC干扰XIAP与半胱天冬酶-9相互作用，抑制细胞凋亡。SMAC与cIAP1/2相互作用，并诱导构象变化，导致自我泛素化和自我分解。
这些结果表明，cIAP1/XIAP的双重拮抗剂可通过外源性和内源性途径，促进细胞凋亡。早期拟肽IAP拮抗剂已从单价形式演变为二价形式，以最大限度地提高其功效（图3）[4]。
近期，Astex Pharmaceuticals推出了第一个非肽型IAP拮抗剂，称为tolinapant，目前作为晚期实体瘤和淋巴瘤的靶标进行临床试验（图3，NCT02503423），加强了IAP作为抗癌治疗靶点的重要性[5]。
图3. 近期开发的第二种线粒体衍生的半胱天冬酶激活剂（SMAC）的凋亡蛋白（IAP）拮抗剂的模拟抑制剂
E3连接酶
E3连接酶可以分成RING、HECT、RBR等家族，每个家族下又有其他分型。目前已知的E3连接酶约有600多种，但在PROTAC中常用配体的相关E3连接酶只有 CRBN、VHL、IAP、MDM2等四种（图4），此外还有DCF15、RNF114、DCAF16、KEAP1、FEM1B等仅有少数配体报导的E3连接酶。
图4. 常见的E3连接酶配体
除此之外，也已开发出了很多新型结构E3连接酶配体，如图5所示新型CRBN配体[6]。
图5. 新型CRBN配体
近些年来，人们也在开发不同的E3连接酶用于PROTAC设计。如2021年，Ishida等人专注于发现用于PROTAC的新型E3泛素连接酶的新方法。这些方法包括分子建模方法，例如基于晶体学数据收集信息的SBDD和FBDD方法、基于活性的蛋白质分析（ABPP）筛查或表型筛查。通过这些方法，他们发现一些可以用于PROTACs设计的E3连接酶（图6）[6]。
图6. 尚未探索用于PROTAC应用的E3泛素连接酶列表
基于IAP设计的SNIPERs
基于IAP抑制剂可以设计SNIPERs，SNIPERs与PROTAC相似，可以招募E3连接酶来降解靶标蛋白，只是用的E3连接酶配体是IAP抑制剂。
乌苯美司（BS）及其衍生物，显示出与IAP的BIR3结构域的结合活性，因此诱导自我泛素化的蛋白酶体降解，或者使其它蛋白泛素化从而被降解。
由于IAP具有如此高的亲和力，人们可以基于BS结构衍生得到SNIPERs（如图7A所示）。Natio等人报道，甲基乌苯美司（MeBS）可以增强癌细胞对癌症药物诱导的细胞凋亡的化学敏感性，从而促进细胞凋亡[7]。
机理研究揭示，MeBS诱导RING依赖性自身泛素化和通过与cIAP1的第三个BIR域结合，诱导cIAP1蛋白酶体降解（如图7B所示）。SAR研究表明，即使用更庞大的基团取代羧酸甲酯，cIAP1水平仍能保持降低，表明MeBS的羧酸甲酯基团没有与cIAP1形成相互作用。这些结果促使Natio等人扩展分子框架以设计SNIPER，从甲基的位置连接接头，该接头进一步连接到对靶蛋白具有内在活性的分子上，如图7C所示。
图7.（A）乌苯美司及其衍生物的分子结构；（B）报道的cIAP降解机制；（C） SNIPERs作用机制
除了乌苯美司及其衍生物之外，化合物1（图3）也被选为开发降解剂的IAP抑制剂，因为它是现有二价IAP拮抗剂的一部分（图3），如化合物20通过泛素蛋白酶体系统（UPS）招募IAP来降解RIPK2（图8）[8]。
图8. 基于IAP设计的PIPK2的PROTAC
异型双功能泛IAP降解剂
E3连接酶不仅可以被用来设计PROTACs或SNIPERs，也可以作为靶标蛋白被降解，之前也已经有很多异型双功能降解剂被报道，如连接CRBN配体和VHL配体招募E3连接酶VHL，来降解CRBN蛋白的降解剂CRBN-6-5-5-VHL，或连接MDM2配体和CRBN配体招募E3连接酶CRBN，来降解MDM2蛋白的降解剂MD-224等（图9）[9]。
图9. 异型双功能E3连接酶降解剂
近期，Seulki等人在EJMC上报道了一类异型双功能泛IAP降解剂，他们合成了十几个化合物，并评估它们在MCF-7细胞中对cIAP1、cIAP2和XIAP的降解作用，最终发现化合物12（图10）在0.1 mM和1 mM浓度时，对cIAP1、cIAP2和XIAP都有超过95%的降解（除了在0.1 mM对cIAP1有87%的降解）[4]。
图10. 化合物12（TD-1092）的结构和降解活性
而且，Yuen在JMC也发表了连接IAP配体和VHL配体或者CRBN配体，来设计异型双功能泛IAP降解剂（图11）[9]。
图11. 异型双功能E3连接酶降解剂
他们设计了三种不同系列的异型双功能降解剂，其中两种与VHL配体不同位置连接而得，另一种与CRBN配体连接，从图12可以看出大部分化合物对三种IAP蛋白有很明显的降解功能。
图12. 三种不同类型的异型双功能降解剂
他们最终发现化合物9对三种IAP蛋白（cIAP1、cIAP2和XIAP）都有很明显的降解作用，而且它对多种细胞系有很明显的抑制生长作用（图13）。
图13. 化合物9的结构与活性
小结
细胞凋亡或程序性死亡是一种天然的细胞周期过程，旨在消除体内不需要或受损的细胞。在健康组织中，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白间存在良好的调节平衡，二者共同作用调控细胞凋亡。但是，癌细胞通过上调抗凋亡蛋白的表达，抑制细胞凋亡，最终导致肿瘤的生长、预后不良和耐药性等问题。
据预测到2030年，细胞凋亡市场规模有望达到36.3亿美元，2022-2030年复合增长率达31.7%。
细胞凋亡抑制蛋白是功能上和结构上相关的蛋白质家族，其作为程序性细胞死亡（细胞凋亡）的内源性抑制剂。IAP可直接结合含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase），抑制Caspase的活性，预防细胞凋亡。
IAP抑制剂可分为Smac模拟物和非肽类小分子两类，其中Smac模拟物可依据结合位点的数目分为单体和二聚体抑制剂，包括LCL161、AT-406等；二聚体抑制剂可激活Caspase-3/7/9的活性，达到促进细胞凋亡的目的，包括APG-1387等。
目前全球尚无IAP抑制剂获批上市，IAP不仅可以作为药物靶标，也可以作为E3连接酶设计SNIPERs降解靶标蛋白（化合物20通过UPS系统招募IAP来降解RIPK2），而且还可以连接其它E3连接酶配体合成异型双功能降解剂（如异型双功能泛IAP降解剂9和12）。
参考资料：
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4.Seulki Park, Dayoung Kim, Woori Lee, Jin Hwa Cho, Sungyoung Kim, Ga Seul Lee, Jeong Hee Moon, Jung-Ae Kim, Jae Du Ha, Jeong-Hoon Kim, Hyun Jin Kim, Discovery of pan-IAP degraders via a CRBN recruiting mechanism, European Journal of Medicinal Chemistry 245 (2023) 114910.
5.N. Crawford, K.J. Stott, T. Sessler, C. McCann, W. McDaid, A. Lees, C. Latimer, J. P. Fox, J.M. Munck, T. Smyth, Clinical positioning of the IAP antagonist tolinapant (ASTX660) in colorectal cancer, Mol. Cancer Therapeut. 20 (2021) 1627–1639.
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7.Arvind Negi, Kavindra Kumar Kesari, and Anne Sophie Voisin-Chiret, Estrogen Receptor-_ Targeting: PROTACs, SNIPERs, Peptide-PROTACs, Antibody Conjugated PROTACs and SNIPERs, Pharmaceutics 2022, 14, 2523.
8.A.H. Miah, I.E. Smith, M. Rackham, A. Mares, A.R. Thawani, R. Nagilla, P.A. Haile, B.J. Votta, L.J. Gordon, G. Watt, Optimization of a series of RIPK2 PROTACs, J. Med. Chem. 64 (2021) 12978–13003.
9.Yuen Lam Dora Ng, Alesa Bricelj, Jacqueline A. Jansen, Arunima Murgai, Kirsten Peter, Katherine A. Donovan, Michael Gutschow, Jan Kronke, Christian Steinebach, and Izidor Sosic, Heterobifunctional Ligase Recruiters Enable pan-Degradation of Inhibitor of Apoptosis Proteins, J Med Chem. 2023 Mar 30.
