1. 甲基化研究的意外发现
像弗莱明偶然发现了青霉素一样，RNA激活现象也是偶然中发现的。那时，李龙承博士正在加州大学旧金山分校（UCSF）从事肿瘤DNA甲基化的研究。在肿瘤细胞中，许多抑癌基因因为启动子区发生高度甲基化而失活，导致了肿瘤的发生，这在当时是很热门的研究领域。在研究了大量的抑癌基因后，一个现象让李博士很是不解，就是同一个抑癌基因在有的肿瘤中存在甲基化失活，而有的肿瘤没有；而在同一种肿瘤中，有的抑癌基因被甲基化沉默了，有的又没有。到底是什么信号决定了哪些基因被甲基化和基因的哪些位置发生甲基化呢？
2004年，李博士注意到植物细胞中存在一种双链RNA（dsRNA）通过Argonaute蛋白途径介导DNA甲基化（RDDM，RNA DirectedDNA methylation）的现象。受这一现象的启发，李博士开始研究人类细胞中是否存在相同的机制。为此，李博士设计了两条针对钙粘素E基因启动子区的dsRNA，希望这两条dsRNA能够作为一种信号分子，指导细胞对靶点区域的DNA进行甲基化，进而下调钙粘素E基因的表达。然而，意外发生了。钙粘素E基因的表达不仅没有下调，反而提高了很多。刚开始李博士也以为是实验操作中出错了，但是后续多次重复实验仍旧是相同的结果，使得他们初步确认一个新的基因调控机制被发现了。之后李博士的实验室在多个基因上都发现了同样的dsRNA激活基因表达的现象，最终于2006年确认了这是独立于RNAi的一种小RNA指导的基因调控方式---RNA激活（RNA activation，简称RNAa）。
熟悉核酸技术发展史的人们应该记得，2006年，当时在华盛顿卡内基研究所的Andrew Fire和马萨诸塞大学医学院的Craig Mello因为发现RNAi机制而分享了当年的诺贝尔奖。可能是因为RNAi技术风头正健，也可能是因为这种现象太不可思议，有关RNAa现象文章的发表并不顺利。历经Science和Nature多次修稿和拒稿之后，终于在RNAi技术获得诺奖的同一年发表于美国科学院院刊（PNAS）。有趣的是，RNAa现象是首先在哺乳动物细胞中发现的，时隔七年之后的2013年，Craig Mello实验室和其他几个实验室在线虫中也观察到了RNAa现象的存在，证明了RNAa在物种之间的保守性。众所周知，很多基础的生物学现象都是在低等的模式动物如线虫、斑马鱼等中发现的，然后在高等动物中得到验证。而RNAa的发现和验证整好是相反的过程，这就说明科学研究的路径不是一成不变的。当有新的现象被揭示时，要有坦然接受的能力。
2. RNAa作用机制
时至今日，关于RNAa的研究越来越多，它的神秘面纱逐步被揭开。当dsRNA（被称为saRNA，小激活RNA）装载到Argonaute2（Ago2）蛋白后，其中的一条链（通常被称为“过客链”，另一条链被称为“引导链”）被Ago2从中间切断并从Ago2复合体中脱落。之后Ago2复合体通过主动转运机制进入细胞核，其与RNA helicase A （RNA解旋酶A，RHA）相互作用形成Ago2-RHA复合体，复合体开始在染色体上寻找与引导链互补的基因序列。一旦找到互补的基因序列并与之结合，Ago-2-RHA复合体招募polymerase-associated factor 1（聚合酶相关因子1，PAF1）形成RITA（RNA-induced transcriptional activation，RNA介导的转录激活）复合体，该复合体进一步招募和激活RNA polymerase II（RNA聚合酶II），导致mRNA表达的增加。具体的通路如下图所示。
图1 RNAa作用机制 （来自参考资料1）
3. RNAa应用，大有可为
人类基因组计划（human genome project，HGP）完成后，后基因组时代已然来临。发现新基因、鉴定基因功能以及基因之间相互关系是后基因组时代的重要课题。由于saRNA诱导的基因激活具有高特异性、高效性和方便性，因此作为一种遗传学技术应用于基因功能研究，对于研究基因的致病机理、药物作用机制等具有重要意义。
而RNAa作为一种稀缺的能够做“加法”的技术，我们预计其在疾病治疗领域，会有更广阔的天地。表1根据美国FDA批准的药物统计了目前所有成药的靶点，包括小分子药物靶点749个，生物制品靶点179个；其中蛋白型靶点856个，非蛋白型靶点37个。蛋白质之所以成为药物靶点的主要类型，是因为蛋白质的三维结构提供了药物结合的位点。这也是目前小分子和抗体药物面临的困境，他们的继续开发依赖于蛋白结构的深入研究并且受到蛋白自身结构的限制。而核酸药物则不受这种限制。人类的39000多个基因，都有可以成为核酸药物的靶点。正是得益于这种优势，RNAa疗法几乎可以应用于我们能够想到的任何疾病领域。例如，在肿瘤领域，可以通过激活抑癌基因实现治疗肿瘤的目的；在心血管领域，可通过激活VEGF治疗缺血性疾病；对于感染性疾病，有人尝试用RNAa机制激活潜伏的HIV-1病毒来达到根除病毒感染的目的。
实际上，RNAa疗法在单基因遗传病方面，尤其是单等位突变导致的基因表达不足而引发的罕见病方面有其特别的优势。对于这类蛋白功能缺失性疾病，虽然基因治疗已经成药，但开发难度极大且有潜在的较为严重的副作用。作为一种简便的靶向基因开启技术，RNAa疗法有可能在罕见病领域大放异彩。
表1 FDA批准药物对应靶点数目汇总
来自参考资料2
4. RNAa可能面临与RNAi不同的成药挑战
目前，已经有两款siRNA药物上市，而作为与siRNA结构类似、功能相反的saRNA进展最快的仍处于二期临床阶段。与siRNA相比，saRNA发挥作用还需要穿透核膜，这样看来saRNA似乎比siRNA的递送更具有挑战性。目前我们已知saRNA从胞质到胞核是一个主动转运的过程，也就是说saRNA只要能跨膜进入细胞质，剩下的入核过程可以交给细胞内源的机制去完成。而与siRNA作用于mRNA相比，saRNA的靶点是DNA，其在每个细胞中的拷贝数（2个）明显低于mRNA（几百上千），加上saRNA对表观遗传产生影响，具有长效性，所以实际上在核内发挥作用的saRNA剂量可大大低于siRNA。即便是考虑细胞核对双链核酸的外排作用，我们仍然可以推测saRNA发挥作用并不会面临比siRNA更大的障碍。当然最终的结论还是需要更多的实验，甚至临床结果去验证。
5. UCSF的专利辗转
早在2005年9月，加州大学就递交了关于RNAa作用机理的美国临时专利申请，期望获得RNAa的机制保护及saRNA在基因激活应用方面的保护。2008年，RNAi领域的领头羊公司Alnylam取得了该技术的许可使用权，开始进行saRNA药物研究，这是RNAa疗法最早的商业开发。遗憾的是，siRNA药物开发初期由于递送和免疫反应的问题屡遭挫折，跨国药企纷纷离场，导致Alnylam自己都艰难度日。最终Alnylam还是决定聚焦于siRNA，暂时放弃saRNA药物开发，saRNA技术的许可使用权也于2012年被加州大学收回。
Dr. Nagy是英国MiNA公司的创始人，本身也是一位多产的发明家，拥有很多外科器械方面的发明，同时在基因治疗、干细胞治疗、内窥镜检查和外科手术方面发表了广泛的著作。2012年的美国小核酸治疗协会年会上，Nagy听到了李龙承博士关于RNAa技术的报告，马上意识到这是一个很有开发前景的技术。Nagy迅速与加州大学联系，在2014年取得RNAa技术的许可使用权，并于2016年开始进行全球第一款saRNA药物的临床研究。光一样的速度！
作为RNAa技术的开拓者，李龙承博士很早就意识到其在制药领域的无限潜力。2008年，旧金山湾区著名的生物医药风险投资公司Alta Partners计划支持李博士成立初创公司开发RNAa技术。因为当时加州大学已经决定将该技术授权给Alnylam，这一计划最终夭折。2015年，加州大学专利获得授权，他们最初设计的RNAa机理的保护并没有得到支持，获得保护的只是有限的靶点和具体的saRNA序列。这对于其他靶点和序列的开发并没有限制作用。李龙承博士终于可以自由开发由他自己开创的技术，中美瑞康公司（Ractigen）应运而生。接下来我们拟对全球唯二的RNAa疗法公司---英国MiNA和中国Ractigen进行解读。
参考资料
1. Treating disease at the RNA level witholigonucleotides, Arthur A. Levin, N Engl J Med, 2019;380:57-70
2. A comprehensive map of molecular drug targets,Rita Santos, et al, Nat Rev Drug Discov. 2017;16(1):19-34
