南极位于地球最南端，气候严寒，风力凛冽，太阳辐射强烈，生存条件严苛，其特有的冻层海洋环境使其蕴藏着十分独特的微生物资源[1]。为了适应极地特有的环境，这些微生物在基因的转录、蛋白的表达及代谢调控方面有着独特的机制，具有产生结构新颖活性化合物的潜力[2-4]。文献研究表明，节菱孢属真菌Arthrinium sp.能够产生多样的次级代谢产物，涵盖了苯并色原酮类[5-6]、香豆素类[7-8]、生物碱类[9-10]、萜类[11]、甾体类[12]等，且这些化合物具有抗菌、抗病毒、细胞毒等生物活性。
本研究对南极来源真菌Arthrinium arundinis（FNJ20）的次级代谢产物及其生物活性开展研究，从中分离鉴定出1个新构型的二萜类化合物（–）arthrinin A（1），5个已知二萜类化合物libertellenone J（2），arthrinins B（3），arthrinin D（4），myrocin A（5），myrocin E（6）以及2个苯并色原酮类化合物conioxanthone A（7），1,3,6-tri-hydroxy-8-methylxanthone（8）（见图1），并对化合物进行了抗菌活性评价。
01
实验部分
1.1仪器与试剂
LaChrom Elite高效液相色谱仪（日本日立公司）；Micromass Q-TOF质谱仪（美国Waters公司）；Agilent DD2 500 MHz型核磁共振波谱仪（美国Agilent公司）；X-单晶衍射仪（德国Bruker公司）；Laborota 2 000/4 000旋转蒸发仪（德国Heidoph公司）；MIR-253 SANYO恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）；酶联免疫检测仪（奥地利Tecan公司）；LDZX-50KBS高压蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；Sephadex LH-20凝胶色谱填料（美国Amersham公司）；硅胶（200~300目，青岛海洋化学公司）。
酵母膏，琼脂，葡萄糖，甘油，DMSO（国药集团化学试剂有限公司）；环丙沙星（上海麦克林生化科技有限公司，生产批号201424）；高效液相色谱仪专用色谱纯甲醇（天津四友精细化工公司）；氘代试剂（美国CIL公司）；提取分离所用甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚等均为工业纯产品。
1.2菌株来源
菌株分离自南极海泥。经过真菌形态和ITS序列比对，确定为真菌Arthrinium arundinis。目前该菌株保存于中国海洋大学海洋药用生物资源室，菌株编号为FNJ20，于甘油中?80℃保存。
1.3菌株发酵
从节菱孢属真菌A.arundinis（FNJ20）菌种冻存管中，将菌种接种到土豆培养基（PDA）平板上复苏，然后将平板上复苏好的菌株琼脂小块接种到大米固体培养基（30 g大米，30 g/1 000 mL的海水约30 mL）中，共发酵200瓶，室温静置培养45d。
1.4提取与分离
将发酵后的菌体用乙酸乙酯浸泡3次，再用二氯甲烷-甲醇（体积比1∶1）浸泡1次，浓缩得到浸膏（270 g）。首先用减压柱对浸膏梯度洗脱，最终获得5个组分（Fr.1~5）。组分Fr.2经过正相柱色谱分离、凝胶柱色谱Sephadex LH-20（洗脱体系为石油醚-二氯甲烷-甲醇，体积比2∶1∶1）分离得到组分Fr.2.1~2.3，组分Fr.2.1经过半制备型高效液相色谱（甲醇-水，体积比9∶1，流速2 mL/min）制备得到化合物1（18.9 mg）。组分Fr.2.3经过半制备型高效液相色谱（甲醇-水，体积比9∶1，流速2 mL/min）制备得到化合物2（15.5 mg）。将组分Fr.3经过硅胶柱色谱分离、凝胶柱层析Sephadex LH-20（洗脱体系为二氯甲烷-甲醇，1∶1），洗脱得到组分Fr.3.1~3.3。组分Fr.3.1经半制备高效液相色谱（甲醇-水，体积比8∶2，流速2 mL/min）得到化合物3（9.8 mg）和4（9.2 mg）。组分Fr.3.2经半制备高效液相色谱（甲醇-水，体积比8∶2，流速2 mL/min）得到化合物5（18.3 mg）和6（7.8 mg）。组分Fr.3.3经半制备高效液相色谱（甲醇-水，体积比7∶3，流速2 mL/min）得到化合物7（15.0 mg）和8（8.2 mg）。
1.5抗菌活性评价
以微量稀释法[13-14]进行化合物的抗菌活性测定。测试菌株包括金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、铜绿假单胞菌（Psmdomonas aeruginosa）、白色念珠菌（Candida albicans）。阳性对照为环丙沙星，阴性对照为DMSO溶液，每个化合物设置3个平行。
02
结果与讨论
2.1化合物的结构鉴定
化合物1：无色晶体，HRESIMS在m/z 327.158 9处给出[M+H]＋峰，确定分子式为C20H22O4，不饱和度为10。在其1 H NMR和13C NMR谱中，δH 1.01（1H，t，J=4.40 Hz，H-20a）和δH 0.68（1H，dd，J=8.55，4.75 Hz，H-20b）处的氢信号及δC 14.5（C-20）、δC 21.3（C-1）和δC 23.3（C-10）处的碳信号，提示了化合物1有环丙基结构。此外，还有1个羰基信号（δC 182.7），1个末端乙烯基信号δC 136.1，δH 6.94（1H，dd，J=11.24，17.98 Hz，H-15）；δC 120.7，δH 5.39（1H，dd，J=11.24，2.32 Hz，H-16a）和δH 5.10（1H，dd，J=17.98，2.32 Hz，H-16b），2个次甲基信号和2个甲基信号。根据以上的核磁数据推测化合物1为二萜类化合物，且该化合物的波谱数据与文献报道已知化合物arthrinin A一致[15]，由此1的平面结构得以确定。以正己烷-甲醇（体积比1∶1）溶解化合物，室温缓慢挥发溶剂获得单晶，通过铜靶单晶衍射获得其单晶数据（见图2），并已经提交到剑桥晶体数据中心，CCDC号为1992569。对单晶数据进行分析确定化合物1的一定构型为1S,4S,5R,6R,7R,10S，与文献报道的arthrinin A的构型相反，最终将化合物1命名为（–）-arthrinin A。
化合物2~6：均为已知的二萜类化合物，其质谱、核磁及旋光数据与文献报道一致，分别确定为libertellenone J（2）[16]，arthrinin B（3）[15]，arthrinin D（4）[15]，myrocin A（5）[17]和myrocinE（5）[16]。
化合物7：白色粉末状固体。ESI-MS在m/z 317处给出[M+H]+峰，提示分子质量为316。1H NMR谱显示了4个均为单峰的芳香氢信号（δH 6.73，6.74，6.82，6.94），13C NMR谱显示了2个苯环上连羟基的碳信号（δC 162.9，167.9）和1个羰基碳信号（δC 181.0），这提示了苯并色原酮骨架的存在。另外，1H NMR和13C NMR谱还显示了1个甲氧基（δC 53.6，δH 3.96），1个亚甲基（δC64.6，δH 4.67）的存在。结合以上信息，对比文献[18]的核磁数据，确定了化合物为conioxanthone A。化合物8：黄色粉末状固体。ESI-MS在m/z259处给出[M+H]+峰，提示分子质量为258。其1H NMR和13C NMR数据与7的相似，也显示了苯并色原酮骨架特征信号。结合以上信息，对比文献[19]的核磁数据，确定了化合物为1,3,6-tri-hydroxy-8-methylxanthone。
2.2化合物波谱数据
Arthrinin A（1）：C20H22O4，1 H NMR（500 MHz，Methanol-d4，δ，J/Hz）δH 6.94（1H，dd，J=11.24，17.98 Hz，H-15），6.48（1H，s，H-12），5.39（1H，dd，J=11.24，2.32 Hz，H-16a），5.24（1H，d，J=7.76 Hz，H-7），5.10（1H，dd，J=17.98，2.32 Hz，H-16b），4.52（1H，dd，J=11.94，7.76 Hz，H-6），3.18（1H，ddt，J=8.91，4.11，2.56 Hz，H-1），2.19（1H，d，J=11.94 Hz，H-5），2.16（3H，s，H-17），2.03（1H，m，H-2a），1.83（1H，dq，J=14.08，3.10 Hz，H-2b），1.57（1H，td，J=13.73，3.75 Hz，H-3a），1.43（1H，m，H-3b），1.27（3H，s，H-18），1.01（1H，t，J=4.40 Hz，H-20a），0.68（1H，dd，J=8.55，4.75 Hz，H-20b）。13C NMR（125 MHz，Methanol-d4，δ）δC 182.7（C-19），150.2（C-11），139.2（C-8），136.1（CH-15），135.0（C-13），132.4（C-14），129.9（C-9），120.7（CH2-16），117.3（CH-12），84.9（CH-6），74.4（CH-7），47.0（CH-5），39.1（C-4），27.8（CH3-18），23.3（C-10），22.8（CH2-3），21.3（CH-1），20.5（CH2-2），20.2（CH3-17），14.5（CH2-20）。HRESIMS m/z 327.158 9[M+H]＋，m/z 349.140 8[M+Na]＋，m/z 365.115 1[M+K]＋，[α]2 5 D–7.87（c=0.1，MeOH）。
Libertellenone J（2）：C21H28O6，1 H NMR（500MHz，Methanol-d4，δ，J/Hz）δH 7.00（1H，d，J=1.87 Hz，H-14），5.93（1H，dd，J=17.49，10.67 Hz，H-15），5.13（1H，dd，J=17.49，1.05 Hz，H-16a），5.06（1H，dd，J=10.67，1.05 Hz，H-16b），4.35（1H，dd，J=10.95，4.76 Hz，H-1），3.64（3H，s，H-21）2.23（1H，td，J=14.50，3.32 Hz，H-11a），2.10（1H，dt，J=14.50，3.32 Hz，H11b），1.96（1H，dd，J=13.13，3.88 Hz，H-3a），1.88（1H，m，H-2），1.81（1H，m，H-12），1.65（1H，ddd，J=12.83，4.21，2.18 Hz，H-3b），1.57（1H，m，H-12），1.50（3H，s，H-18），1.22（3H，s，H-20），1.16（3H，s，H-17）。13C NMR（151 MHz，Methanol-d4，δ）δC 182.9（C-7），180.3（C19），148.9（CH-14），147.6（CH-15），146.1（C-6），140.5（C-5），135.9（C-8），112.8（CH2-16），76.4（C-9），69.7（CH-1），52.9（CH3-21），50.3（C-10），47.6（C-4），39.7（C-13），35.3（CH2-3），31.0（CH2-12），29.8（CH2-11），28.7（CH2-2），23.8（CH3-17），22.3（CH3-18），22.9（CH3-20）。ESI-MS m/z:377[M+H]+，[α]2 5 D–32.7（c=0.1，MeOH）。
Arthrinin B（3）：C20H22O3，1 H NMR（500 MHz，Methanol-d4，δ，J/Hz）δH 7.00（1H，s，H-14），6.61（1H，dd，J=18.08，11.50 Hz，H-15），5.60（1H，dd，J=11.50，1.99 Hz，H-16b），5.41（1H，dd，J=18.08，1.99 Hz，H-16a），4.93（1H，d，J=8.71 Hz，H-7），4.43（1H，dd，J=11.41，8.71 Hz，H-6），3.16（1H，ddt，J=9.00，4.16，2.56 Hz，H-1），2.27（1H，d，J=11.41 Hz，H-5），2.22（3H，s，H-17），2.07（1H，td，J=13.83，3.35 Hz，H-2b），1.84（1H，dq，J=14.11，3.08 Hz，H-2a），1.60（1H，td，J=13.83，3.35 Hz，H-3a），1.46（1H，dt，J=14.11，3.08 Hz，H-3b），1.29（3H，s，H-18），1.02（1H，t，J=4.38 Hz，H-20a），0.60（1H，dd，J=8.60，4.71 Hz，H-20b）。13C NMR（125 MHz，Methanol-d4，δ）δC 183.6（C-19），149.0（C-11），139.1（C-8），133.4（C-13），131.5（CH-15），130.1（CH-9），125.2（C-12），122.7（CH-14），120.1（CH2-16），85.5（CH-6），75.5（CH-7），47.2（CH-5），39.0（C-4），27.1（CH3-18），23.6（C-10），22.7（CH2-3），21.3（CH-1），20.0（CH2-2），19.2（CH3-17），14.0（CH2-20）。ESIMS m/z 311[M+H]+，[α]2 5 D+14.2（c=0.1，MeOH）。
Arthrinin D（4）：C20H24O5，1 H NMR（500 MHz，Methanol-d4，δ，J/Hz）δH 6.73（1H，dd，J=17.84，11.34 Hz，H-15），6.56（1H，d，J=0.92 Hz，H-12），5.49（1H，dd，J=11.34，2.29 Hz，H-16a），5.34（1H，dd，J=17.84，2.29 Hz，H-16b），5.13（1H，s，H-7），3.58（1H，q，J=7.05 Hz，H-6），2.15（3H，s，H-17），2.32（1H，s，H-5），1.99（1H，tdd，J=12.49，4.54，2.48 Hz，H-3a），1.77（1H，m，H-3b），1.72（1H，dd，J=14.37，4.68 Hz，H-2a），1.45（1H，ddd，J=14.37，4.46，2.48 Hz，H-2b），1.38（3H，s，H-18），1.15（1H，t，J=7.05 Hz，H-1），0.89（1H，t，J=5.51 Hz，H=20a），0.43（1H，dd，J=8.43，5.89 Hz，H-20b）。13C NMR（125 MHz，Methanol-d4，δ）δC 183.3（C-19），152.3（C-11），137.3（C-9），134.6（C-14），134.2（CH-15），131.2（C-8），118.8（CH2-16），117.8（CH-12），72.0（CH-7），57.0（CH-6），52.6（CH-5），41.7（C-4），28.2（CH3-18），26.8（CH2-2），19.3（CH3-17），18.6（CH2-3），17.9（C-13），17.0（CH-1），16.6（C-10），14.3（CH2-20）。ESI-MS m/z:345[M+H]+，367[M+Na]+，[α]2 5 D+24.6（c=0.1，MeOH）。
Myrocin A（5）：C20H22O6，1 H NMR（500 MHz，Acetone-d6，δ，J/Hz）δH 6.83（1H，d，J=1.57 Hz，H-14），5.69（1H，dd，J=17.67，10.31 Hz，H-15），5.01（1H，d，J=1.38 Hz，H-16a），4.98（1H，dd，J=5.00，0.75 Hz，H-16b），2.90（1H，d，J=13.42 Hz，H-12a），2.52（1H，dd，J=13.42，1.57 Hz，H-12b），2.07（1H，m，H-2a），1.84（1H，m，H-2b），1.82（1H，m，H-3a），1.79（1H，m，H-1），1.44（1H，m，H-3b），1.43（3H，s，H-17），1.42（3H，s，H-19），1.09（1H，t，J=6.28 Hz，H-20a），0.83（1H，dd，J=8.97，6.28 Hz，H-20b）。13C NMR（125 MHz，Acetone-d6，δ）δC 208.8（C-11），182.9（C-7），177.8（C-19），145.1（C-6），143.8（CH-14），142.7（CH-15），137.5（C-8），132.6（C-5），115.2（CH2-16），76.7（C-9），53.9（CH2-12），44.9（C-4），43.3（C-13），29.8（CH2-3），27.6（C-10），27.5（CH3-17），20.0（CH3-18），18.2（CH2-2），16.9（CH-1），12.4（CH2-20）。ESI-MS m/z：359[M+H]+，381[M+Na]+，[α]2 5 D–32.1（c=0.1，MeOH）。
Myrocin E（6）：C20H24O6，1 H NMR（500 MHz，Acetone-d6，δ，J/Hz）δH 6.82（1H，d，J=1.43 Hz，H-14），5.83（1H，dd，J=17.47，10.57 Hz，H-15），5.03（1H，dd，J=17.47，1.10 Hz，H-16a），4.98（1H，dd，J=10.57，1.10 Hz，H-16b），3.91（1H，d，J=3.93 Hz，H-11），3.47（1H，d，J=1.13 Hz，H-5），2.87（1H，m，H-12a），2.36（1H，dd，J=14.27，2.49 Hz，H-1），1.78（1H，m，H-3a），1.76（1H，m，H-2a），1.74（1H，m，H-2b），1.66（1H，ddd，J=14.25，3.72，1.43 Hz，H-12b），1.48（3H，s，H-19），1.44（1H，m，H-3b），1.33（3H，s，H-17），0.63（1H，dd，J=6.33，3.99 Hz，H-20a），0.14（1H，t，J=14.87 Hz，H-20b）。13C NMR（125 MHz，Acetone-d6，δ）δC 193.3（C-7），182.9（C-18），148.4（CH-14），147.4（CH-15），133.7（C-8），112.3（CH2-16），97.2（C-6），72.7（C-9），69.4（CH-11），47.3（CH-5），41.8（C-4），39.7（C-13），39.1（CH2-12），29.7（CH3-19），29.6（CH2-3），27.2（CH3-17），25.1（C-10），19.5（CH2-2），14.4（CH-1），7.4（CH2-20）。ESI-MS m/z:361[M+H]+，383[M+Na]+，[α]2 5 D–8.37（c=0.1，MeOH）。
Conioxanthone A（7）：C16H12O7，1 H NMR（500 MHz，Methanol-d4，δ，J/Hz）δH 6.94（1H，s，H-4），6.82（1H，s，H-5），6.74（1H，s，H-7），6.73（1H，s，H-2），4.67（2H，s，H-10），3.96（3H，s，H-12）。13C NMR（125 MHz，Methanol-d4，δ）δC 181.0（C-9），171.7（C-11），167.9（C-6），162.9（C-1），160.1（C-5a），157.6（C-4a），153.6（C-3），136.7（C8），115.0（CH-7），109.0（CH-2），108.4（C-8a），108.1（C-1a），105.4（CH-4），104.7（CH-5），64.6（CH2-10），53.6（CH3-12）。ESIMS m/z:339[M+Na]+。
1，3，6-trihydroxy-8-methylxanthone（8）：C14H10O5，1 H NMR（500 MHz，Methanol-d4，δ，J/Hz）δH 6.57（1H，s，H-2），6.56（1H，s，H-4），6.08（1H，d，J=2.19 Hz，H-5），6.19（1H，d，J=2.19 Hz，H-7），2.74（3H，s，H-11）。13C NMR（125 MHz，Methanol-d4，δ）δC 183.6（C-9），166.2（C-6），165.0（C-8），164.4（C-3），161.0（C-4a），158.8（C-10a），144.9（C-1），117.2（CH-2），113.0（C-1a），104.2（C-9a），101.7（CH-4），99.0（CH-7），94.4（CH-5），23.7（CH3-11）。ESIMS m/z:259[M+H]+。
2.3化合物1单晶数据
C20H22O4（M），Mr=326.37，该晶体为单斜晶，所在空间群为P2（1）；晶胞参数为a=10.199 8（5）?，b=7.157 7（4）?，c=11.739 4（6）?，α=90°，β=103.098（5）°，γ=90°，V=834.76（8），Z=2，Dcalc=1.298 g/cm3，μ（Cu Kα）=0.726 mm–1，F（000）=348.0。独立衍射点：5110（Rint=0.032 0）。R1值为0.038 6，flack常数为0.1（3），wR2=0.099 5[I>2σ（I）]，化合物1的单晶数据已经提交到剑桥单晶数据中心，CCDC号为1992569。
2.4抗菌活性评价
采用微量稀释法对分离到的化合物进行抗菌活性评价。结果显示，化合物8具有对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌显著的抑制活性，MIC值分别为6.25和12.50μmol/L。阳性对照环丙沙星的MIC值为3.125μmol/L。
03
结论
本研究从南极海泥来源节菱孢属真菌A.arundinis（FNJ20）的发酵提取物中分离并鉴定了6个二萜类化合物（1~6）及2个苯并色原酮类化合物（7~8），并通过单晶确定了化合物1的一定构型。化合物8对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌有显著的抑制活性，为该菌次级代谢产物的进一步应用提供了基础资料。
