抗体领域无疑是近几年最火的研发领域，不论是从融资金额，融资数量，获批药物数量还是从抗体药物销售额都可以看出这个领域的前景和价值。
随着抗体技术的发展，不仅开发出单克隆抗体，双特异性抗体，三特异性抗体，也基于抗体开发很多药物偶联物，包括抗体药物偶联物（ADC），肽-药物偶联物（PDC），多肽-药物偶联物 （polyDC），小分子药物偶联物（SMDC）、免疫刺激抗体偶联物（ISAC）、抗体片段药物偶联物（FDC）和适体药物偶联物（ApDC）等。
从全球角度看，全球治疗性抗体行业市场规模持续增长，2021年全球治疗性抗体市场规模超过2000亿美元，达到2054亿美元，同比增长15.98%。
目前单克隆抗体获批的超过100种，双特异性抗体获批的有8种，三特异性抗体暂时没有获批，而基于抗体设计的ADC全球获批已达15种，种种迹象表明抗体巨大的市场和开发价值。
抗体又称免疫球蛋白，是由B淋巴细胞接受刺激后产生的糖蛋白，结构呈“Y”字型，具有特异性结合抗原的功能，在人体抵御外界感染性病原体中发挥重要作用。
自1986年第一个单克隆抗体Orthoclone OKT3被批准用于肾移植受者急性同种异体移植排斥反应的治疗，基于抗体的疗法数量显著增加，目前超过130种单克隆抗体可用。
2022年，美国或欧盟首次批准的单克隆抗体疗法有8种，如表1所示。
通过工程化抗体的Y形结合位点以同时识别两种不同的抗原，可以提高治疗效力，这种分子被称为双特异性抗体（BsAb），起到桥梁的作用，一个位点与肿瘤特异性抗原结合，另一个位点与免疫细胞结合以激活宿主免疫反应。
BsAb在单个抗体中含有两个靶标结合单元，表现出两种不同的Fab（抗原结合片段）状态。它充当具有不同作用模式的两种抗原之间的桥梁。到目前为止，已经生产了一百多种BsAb，并且仍在进行广泛的研究。表2显示目前被批准的BsAb。
除此之外，人们进一步开发了三特异性抗体，导致治疗特异性和效果的进一步增强。目前还没有获批的三特异性抗体，但是在研的也有很多。下面详细介绍一下这些抗体利用哪些细胞进行杀伤肿瘤细胞作用。
BiTE是一种具有独特功能的双特异性抗体构建体，同时结合肿瘤细胞上的抗原和T细胞上的表面分子以诱导肿瘤溶解。BiTE是通过替换两个绑定的臂而开发的具有两个不同的单链可变片段（scFvs），以形成具有柔性甘氨酸-丝氨酸接头的二体。这种新颖的形式不仅提高了产量，而且还通过两者scFvs促进了与不同抗原的结合（图1A）[1]。
一个scFv结合B细胞淋巴瘤的生物标志物，例如CD19或B细胞成熟抗原（BCMA），而另一种特异性结合T细胞表面标志物CD3以激活T细胞功能（图1B）[2]。
博纳吐单抗（Blinatumomab，抗CD3 / CD19）是B细胞前体急性淋巴细胞白血病（ALL）的治疗方法，是第一个也是目前为止唯一一个被批准的BiTE药物，由两个主要片段组成：抗CD3 scFv（VL-VH）和抗CD19 scFv（VL-VH）。接头主要由小的甘氨酸和丝氨酸残基组成，并在每个scFv中连接VL和VH，并连接两个scFv（图1A）。
靶向BCMA和CD3的BiTE分子AMG420的一项临床I 期试验 （NCT02514239）在复发/难治性多发性骨髓瘤患者中实现了70%的总缓解率，最大耐受剂量（MTD）为400μg每天。除此之外，大多数BiTE的开发仍处于临床前和早期临床试验阶段[3]。
免疫系统通常由两支手臂组成，即先天性和适应性免疫反应，它们协同抵御入侵病原体。虽然免疫系统的两个臂都包含多种细胞类型，但NK细胞被认为是先天免疫反应的组成部分。
NK细胞在治疗中的应用根据癌症类型高度多样化。迄今为止，相关的治疗剂包括细胞因子补充剂、单克隆抗体和基因工程NK细胞。
NK细胞接合器（NKCEs）和CAR-NK细胞被设计用来利用NK细胞介导的细胞毒 性来对抗肿瘤。NKCE是通过连接抗NK细胞受体（主要是CD16）和一个TAA (bispecific killer engagers, BiKEs）或两个TAA（trispecific killer engagers, TriKEs）的单链抗体来构建的。到目前为止，抗CD16的BiTEs已经被有效地用于针对广泛的TAA，包括CD19、CD20、CD30、CD33、CD133和EPCAM。
由于基于抗体的癌症治疗的进步，FDA已经批准了几种可以激活NK细胞的mAb，例如阻断免疫检查点分子的抗PD-L1单克隆抗体，并且可以显着诱导NK细胞功能破坏肿瘤细胞。
活化的NK细胞表达CD16受体，也称为Fcγ受体（FcγR）IIIa，其与抗体的Fc区域结合并诱导细胞因子的释放，包括TNF-α和IFN-γ，导致肿瘤细胞凋亡（图2）。作为直接介导NK细胞毒 性的裂解受体，CD16与各种抗体的Fc部分结合可以促进NK细胞介导的ADCC。CD16有两种亚型（CD16a和CD16b），具有不同的表达谱和功能[4]。
与T细胞结合疗法相比，NK细胞疗法具有更长的半衰期（长达19小时），并且病人可以更好地耐受。已经开发出各种双特异性杀伤细胞结合剂（BiKE），以同时结合NK细胞和肿瘤细胞上的抗原，从而增强NK细胞的细胞毒 性作用。
AFM13是最成功的BiKE之一，是一种双特异性四价嵌合抗体构建体，靶向CD16a和CD30，用于治疗CD30阳性淋巴瘤。
AFM13结构如图3所示，全功能T和Ab抗体是通过组成结构域的免疫球蛋白重链（VH）和轻（VL）可变链的非共价相互作用，以头到尾的方式对单个多肽进行同源二聚化而形成的[5]。
临床I期试验（NCT01221571）结果显示AFM13是耐受的，安全的，并且对难治性和/或复发性霍奇金淋巴瘤患者有效。更具体地说，在这项剂量递增研究中，总计28名患者接受AFM13的剂量为0.01至7mg 每千克体重，结果显示未达到 MTD。26例可评估患者中有3例（11.5%）达到部分缓解，13例（50%）病情稳定，总体疾病控制率为61.5%。
II期研究（NCT03192202）旨在优化AFM13的给药方案以提高其治疗效果正在进行中。此外，另外I期研究（NCT04074746）在MD安德森癌症中心进行，旨在检查AFM13和来自脐带血修饰NK细胞组合和AFM13单独对抗 CD30 阳性霍奇金淋巴瘤或复发性/难治性非霍奇金淋巴瘤的功效。
另一项评估AFM13在R/R CD30阳性T细胞淋巴瘤或转化型蕈样真菌病（重定向）患者中的II期研究(NCT04101331)也在进行中。
另一个BiKE结构化合物AF M24是识别人类表皮生长因子受体（EGFR）改善NK细胞和巨噬细胞对抗EGFR阳性肿瘤细胞的毒 性。AF M24单药治疗I期临床试验中在晚期实体恶性肿瘤患者中显示出有希望的结果。AF M24与SNK01联合用于表达EGFR的晚期/转移性癌症受试者的安全性、耐受性和抗肿瘤活性的临床I/II期（NCT05099549）试验正在招募种。
另一项临床II 期试验 （NCT04259450）来评估治疗多种肿瘤类型的总缓解率也在进行中。除此之外，还有很多临床前在研的通过NK细胞介导肿瘤杀伤作用的双抗[4]。
整合素相关蛋白（IAP，即CD47）是一种重要的自我信号，它通过与巨噬细胞上的配体信号调节蛋白α（SIRPα）结合，进而抑制巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬；此外，在天然免疫细胞如树突状细胞等向适应性免疫T细递呈抗原的过程中，CD47也发挥着抑制作用。
而且，一些肿瘤细胞也在其表面表达CD47，如非霍奇金淋巴瘤（NHL），AML，胶质母细胞瘤，卵巢癌，乳腺癌和结肠癌，可以帮助它们逃避宿主免疫监视。因此，CD47在肿瘤免疫中发挥着重要的调节作用，靶向CD47是一个潜在的抗肿瘤方向。
但是，要注意的是CD47是一种跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族，也存在于各种造血细胞，尤其是红细胞（RBC）和血小板以及非造血细胞，这可能会限制抗体对实体瘤的影响。
辉瑞开发了靶向CD47/PD-L1的双特异抗体PF-07257876，靶向这两个靶点的抗体也是国内开发较多的双特异抗体。PF-07257876设计中，为了防止CD47对红细胞等细胞的结合而引起严重的副反应，其采用了差异化的结合能力——抗体对PD-L1有高亲合力而对CD47有较低的亲合力，两者亲合力相差2个数量级以上（对PD-L1的亲合力为0.227 nM，对CD47的亲合力为59.5 nM）（图4）[6]。
同时为了增加抗体的药效，该抗体采用IgG1亚型，并且具有ADCP和ADCC等效应。PF-07257876对PD-L1具有更高的亲合力，因此使得抗体更多的聚集于肿瘤微环境中而不是外周血（图5）。
PF-07257876的疗效目前正在一项I期临床试验（NCT04881045）中评估，用于晚期非小细胞肺癌（NSCLC），鳞状细胞癌或卵巢癌的患者。
Amivantamab（JNJ-6372）是一种具有免疫细胞导向活性的EGFR-间质表皮转化因子（MET）双特异性抗体，靶向激活和耐药EGFR及MET突变及扩增（图6）。该药是强生与丹麦Genmab公司合作基于DuoBody平台研发针对EGFR第20号外显子有插入突变的肺癌患者[7]。
Amivantamab已被批准用于转移性NSCLC患者（NCT04599712），目前正在参与一项II期临床试验（NCT04945733）。
最近，三特异性抗体也被积极研究以增强免疫细胞的抗肿瘤活性。三特异性抗体构建介导的免疫细胞杀伤肿瘤细胞的作用机制如图7所示，包括A. 两个通过T细胞的结合位点CD3和CD28靶向T细胞以及一个通过CD38靶向肿瘤细胞；B. 两个通过CD16和IL15R靶向NK细胞和一个靶向肿瘤细胞的结合位点，如CD33用于白血病治疗。
NM21-1480是一种靶向PD-L1、4-1BB 和人血清白蛋白 （HSA）的三特异性抗体。目前一项NM21-1480成年NSCLC患者的II期临床试验（NCT04442126）正在招募。
Harpoon Therapeutics公司研发了四种三特异性抗体进入临床试验[8]包括HPN217（NCT04184050），HPN328（NCT04471727)，HPN424（NCT03577028）和HPN536(NCT03872206)。
HPN217是一种BCMA靶向T细胞结合双特异性，含有三种人源化抗体衍生的结合域，包括BCMA（用于多发性骨髓瘤细胞结合），白蛋白（延长半衰期）和CD3（用于 T 细胞接合），治疗复发/难治性多发性骨髓瘤（RRMM）。大多数应答者在治疗第2周时sBCMA降低以及在许多达到 ≥VGPR 的应答者中，sBCMA 在 9 个月时仍然无法检测到（图8）。
HPN328 是一种源自 TriTAC? 平台的DLL3靶向 T 细胞接合剂。HPN328 包含 3 个结合域，设计用于重定向T细胞以杀死表达DLL3的癌细胞，包括抗DLL3（用于目标参与），抗白蛋白（延长半衰期）和抗 CD3（用于 T 细胞接合）。HPN328 与 CD3 和 DLL3 单价结合，最大限度地减少非特异性 T 细胞活化，在一位61岁患者中开始用1.215mg HPN328治疗，后来剂量增加到7.0mg HPN328，看到部分缓解：第 10 周目标病变直径总和减少 53%（图9）。
目前三特异性抗体还没有获批上市的产品，大部分都处于早期研发阶段。
抗体药行业是近些年发展十分迅猛的行业，是当前生物药中复合增长率最高的一类药物，不论是从融资金额，融资数量，获批药物数量还是从抗体药物销售额都可以看出这个领域的前景和价值。
抗体的研发也越来越成熟，不仅开发单克隆抗体，双特异性抗体，三特异性抗体，也基于抗体开发很多药物偶联物，包括抗体药物偶联物（ADC）等。
双特异性抗体和三特异性抗体可以通过T细胞，NK细胞和巨噬细胞介导的杀死肿瘤细胞。
与T细胞结合疗法相比，NK细胞疗法具有更长的半衰期（长达19小时），并且病人可以更好地耐受。而且，BiKE和TriKE还比T细胞接合器具有更低的毒 性和更高的安全性，这意味着CRS或非靶向细胞毒 性的风险更低，在实体肿瘤中的应用前景更广阔。与NKCE类似，成熟的NK细胞也可以作为一个有趣的候选细胞来表达CARs，对抗丰富的TAA，如CD19、CD20、CD244和HER2。
References
1.Yeji Hong, Su?Min Nam, Aree Moon, Antibody–drug conjugates and bispecific antibodies targeting cancers: applications of click chemistry, Archives of Pharmacal Research 2023
2.Blinatumomab Extends Survival for Patients with Advanced ALL, Cancer Currents Blog
3.A. Pipeline, https://www.amgenpipeline.com/ (accessed: April, 2022).
4.Yaping Sun and Jian Xu, Emerging Antibodies in Cancer Therapy, Adv. NanoBiomed Res. 2023, 3, 2200083
5.Achim Rothe, Stephanie Sasse, Max S Topp, Dennis A Eichenauer, Horst Hummel, Katrin S Reiners, Markus Dietlein, Georg Kuhnert, Joerg Kessler, Carolin Buerkle, Miroslav Ravic, Stefan Knackmuss, Jens-Peter Marschner, Elke Pogge von Strandmann, Peter Borchmann, Andreas Engert, A phase 1 study of the bispecific anti-CD30/CD16A antibody construct AFM13 in patients with relapsed or refractory Hodgkin lymphoma, Blood. 2015 Jun 25;125(26):4024-31.
6.Shih-Hsun Chen, Pawel K Dominik, Jessica Stanfield, Sheng Ding, Wenjing Yang, Nadia Kurd, Ryan Llewellyn, Jonathan Heyen, Carole Wang, Zea Melton, Thomas Van Blarcom, Kevin C Lindquist, ja vier Chaparro-Riggers, Shahram Salek-Ardakani, Dual checkpoint blockade of CD47 and PD-L1 using an affinity-tuned bispecific antibody maximizes antitumor immunity, J Immunother Cancer. 2021 Oct;9(10):e003464.
7.Joost Neijssen, Rosa M. F. Cardoso, Kristen M. Chevalier, Luus Wiegman, Thomas Valerius, G. Mark Anderson, Sheri L. Moores, Janine Schuurman, Paul W. H. I. Parren, William R. Strohl, and Mark L. Chiu, Discovery of amivantamab (JNJ-61186372), a bispecific antibody targeting EGFR and MET, J. Biol. Chem. (2021) 296 100641
8.Https://www.harpoontx.com
